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實時熒光定量PCR試劑盒的常見問題及解決策略
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：64 更新時間
：2024-06-25
實時熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR
，簡稱qRT-PCR）技術
，因其高靈敏度
、高特異性和高定量準確性
，已成為分子生物學研究中不可少的工具
。然而
，在實際使用過程中
，實時熒光定量PCR試劑盒經常會遇到一些常見問題
，影響了實驗結果的準確性和可靠性
。本文將對這些問題進行梳理
，並提出相應的解決策略
。
一
、常見問題
1.無CT值（信號）出現
無CT值出現是qRT-PCR實驗中最為常見的問題之一
。可能的原因包括
：反應循環數不足
、檢測熒光信號的步驟有誤
、引物或探針降解
、引物或探針設計不合理
、模板量不足或模板降解等
。
2.CT值出現過晚
CT值出現過晚通常意味著PCR擴增效率較低
。可能的原因包括
：擴增效率低
、PCR反應過程中退火及延伸的時間過短或過長
、MgCl2濃度不合適
、循環數設置不足
、引物或探針設計有誤等
。
3.標準曲線的線性關係不佳
標準曲線的線性關係不佳通常意味著PCR反應中存在不穩定因素
，影響了實驗結果的定量準確性
。可能的原因包括：加樣存在誤差
、標準品出現降解等
。
二
、解決策略
1.針對無CT值出現的解決策略
（1）確保反應循環數足夠
。一般而言
，循環數應設置在35至45個之間
，避免背景信號過高影響結果
。
（2）檢查熒光信號檢測步驟是否正確
。根據試劑盒說明書或實驗方法
，確保在正確的PCR反應步驟中采集熒光信號
。
（3）通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解
。若發現降解現象
，應重新製備引物和探針
。
（4）優化引物和探針的設計
。根據目的基因的特性
，設計合適的引物和探針
，避免引物跨越內含子或探針設計在擴增片段的5'端等可能導致擴增效率低的問題
。
（5）確保模板量足夠且未降解
。對於未知濃度的樣品
，應從係列稀釋樣本的最高濃度做起
，避免模板量不足導致無CT值出現
。同時
，注意樣品的儲存條件
，避免反複凍融導致模板降解
。
2.針對CT值出現過晚的解決策略
（1）優化PCR反應條件
。如適當降低退火溫度
、調整延伸時間等
，以提高PCR擴增效率
。
（2）檢查MgCl2濃度是否合適
。按0.5mM的間距調整MgCl2的濃度
，找到適合本實驗條件的濃度
。
（3）重新設計引物和探針
。若引物或探針設計不合理
，可能導致擴增效率低
，應重新設計並優化
。
（4）確保PCR產物長度合適
。PCR產物長度一般應在80至150bp之間，過長或過短都可能影響擴增效率
。
3.針對標準曲線線性關係不佳的解決策略
（1）確保加樣準確
。注意每次加樣的一致性及移液器的校正
，避免加樣誤差導致標準曲線線性關係不佳
。
（2）確保標準品質量穩定
。避免標準品反複凍融或長時間儲存導致降解
，應重新製備並稀釋標準品
。
實時熒光定量PCR試劑盒在使用過程中可能會遇到各種問題
，但通過仔細排查原因並采取相應的解決策略
，可以確保實驗結果的準確性和可靠性
。
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